Kurzkohärente digitale Holographie

für mikroskopische Untersuchungen

Die Untersuchung von 3D-Mikrostrukturen gewinnt zunehmend an Bedeutung. Das gilt sowohl für technische als auch für biologische Objekten. Beispiel hierfür sind z. B. Gewebeproben, deren 3D Zellstrukturen verschiedene Grössen haben, in verschiedenen Tiefen liegen und dazu verschiedene optische Eigenschaften aufweisen (Transmission, Reflexion, Brechungsindex).

Zur Darstellung der Struktur von mikroskopischen Objekten, hat es zahlreiche Ansätze gegeben. Dazu gehören die Optische Kohärenz-Tomographie (OCT) und die Konfokale Mikroskopie. Die kurzkohärente digitale Holographie ist ein anderes optische Verfahren, die es erlaubt Phase und Amplitude der Wellenfronten zu bestimmen. Diese Informationen können zur Charakterisierung von 3D-Mikrostrukturen verwendet werden.

Prinzip der kurzkohärenten digitalen Holografie

Zur Registrierung der Hologramme wird eine In-line- Anordnung mit einer kurzkohärenten Lichtquelle verwendet (Abb. 1). Der Lichtstrahl wird in zwei Teile durch den Lichtstrahlteiler aufgespaltet. Ein Teil wird als Referenz und der andere für die Objektbeleuchtung benutzt. Das durch die Probe reflektierte Licht interferiert schliesslich mit dem Referenzlicht. Wenn Objekt- und Referenzpfad die gleiche Länge haben, entsteht ein Interferenzmuster (Hologramm), welches mit dem CCD-Sensor aufgenommen wird. Es werden keine Linsen für die Abbildung des Objektes auf die CCD verwendet. Mehrere Hologramme werden mit dem Referenzspiegel an verschiedene Positionen registriert. Der Referenzspiegel wird dabei mit einem Versteller bewegt. Aus der Hologramm in der CCD Ebene kann die Rekonstruktion des Objektes in einem Abstand d vom Hologramm mit Hilfe der Beugungs- Relation simuliert werden. Der Vorteil in Bezug auf die klassische Mikroskopie, bei der ein Objektiv benutzt wird, ist, dass hier die ganze 3D- Information des Objektes auf dem Hologramm vorhanden ist. Man kann das Objekt in verschiedenen Ebenen rekonstruieren. Die kurzkohärente Methode erlaubt Flächenschnitte durch das Messobjekt zu visualisieren.

Abbildung 1. Optischer Aufbau für die digitale holographische Mikroskopie mit einem kurz-kohärenten Laser als Lichtquelle (c)
Abbildung 1. Optischer Aufbau für die digitale holographische Mikroskopie mit einem kurz-kohärenten Laser als Lichtquelle

Ergebnisse

Ein Beispiel einer Messung ist in Abbildung 2 zu sehen. Für diese Untersuchung wurde eine Fliege als Messobjekt verwendet. Ein fokussiertes Bild des Objekts wurde durch digitale Simulation rekonstruiert. Die Rekonstruktion erfolgt nur für die Punkte des Objekts, die mit dem Referenzlicht kohärent interferieren können; daher zeigen die Bilder Flächenschnitte durch das Messobjekt.

Abbildung 3 zeigt ein anderes Beispiel, bei dem Flächenschnitte durch ein Stück Knochen an verschiedenen Ebene unter der Oberfläche visualisiert werden.

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Abbildung 2 . Bild des Messobjekts (oben). 6 Hologramme eines Teils einer Fliege an verschiedene Positionen des Referenzspiegels wurden registriert und rekonstruiert. Die Differenz der Spiegelpositionen zwischen 2 Bildern ist 100 µm .

 (c)
Abbildung 3 . 5 Hologramme eines Teils eines Knochens an verschiedenen Positionen des Referenzspiegels wurden registriert und rekonstruiert. Die Differenz der Spiegelpositionen zwischen 2 Bildern ist 50 µm .

Referenzen

  1. Pedrini, G., Schedin, S., "Short coherence digital holography for 3D microscopy", Optik, Vol. 112, No. 9, S. 427-432, (2001)
  2. Pedrini G., Tiziani H. J.,“Short-coherence digital microscopy by use of a lensless holographic imaging system”, Appl. Opt. 41, 4489-4496 (2002)
  3. Martinez-Leon, Ll, Pedrini, G., Osten, W., " Short-coherence digital holography for the investigation of 3D microscopic samples" Proc . SPIE, 2004
  4. Martinez-Leon, Ll, Pedrini, G., Osten, W., " Applications of short-coherence digital holography in microscopy", submitted for publication to Appl. Opt.